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哥伦比亚: 2019诺奖化学奖会给生物学家吗 这种DNA验证技术呼声高

2019年10月09日 05:26 来源:科技日报 参与互动 
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  2019诺奖化学奖会给生物学家吗 这种DNA验证技术呼声高

  本报记者 张佳星

  诺贝尔生理或医学奖已然揭晓,但生物学家们还有机会。

  据统计,1990年以来,有16次诺贝尔化学奖颁给了生物学方面的成就。以2017和2018年为例,诺贝尔化学奖就分别颁给了发明冷冻电镜和对活性蛋白质的定向进化研究。

  被称为诺贝尔风向标的引文桂冠奖,今年其化学奖也有两项与生命科学密切相关,当看到Southern(直译“南方”)的鼎鼎大名时,记者当即决定“押宝”这个无处不在的DNA验证技术。

  Southern印迹法由埃德温·萨瑟恩(Edwin Southern)在英国医学研究理事会从事科学研究时发明,相关论文首次发表时他仅仅35岁,以他名字命名的DNA印迹技术,可用于确定特定DNA序列,并判断其功能、是否变异、图谱位置等,他后续还发明了DNA芯片等技术。引文桂冠奖称他的发明是高通量核酸分析工作及基因图谱、诊断和筛查的开端,也是当今个性化医疗的基础。

  可检测遗传病中的单基因突变

  2007年江苏省高考生物学试卷中有一道关于Southern印迹法的试题,题目给出Southern印迹试验后获得的图像,请学生判断不同的条带说明了什么生命科学意义——

  单基因遗传病可以通过核酸杂交技术(Southern印迹法)进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB,镰刀型细胞贫血症患者的基因型为Bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者,为了能生下健康的孩子,每次妊娠早期都进行产前诊断。题目给出产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否患有镰刀型细胞贫血症。

  其中提到的B和b体现在DNA上仅仅是一个碱基的区别,如何能够将其区分开来呢?Southern印迹法做到了。

  它的原理可以形象理解为“钓鱼执法”和“打出原形”两步——

  B和b由于一个碱基的不同在不同的酶切反应中就会反应不同,通过特定酶的“钓鱼执法”,两种基因“你向左,我向右”,但在外表还看不出来,这时候“锁住原形”(转移到尼龙膜等能锁住DNA的膜上)通过可显影的放射性同位素等做标记,让探针DNA把锁住的原形呈现出来,实现“可视化”。由此,通过Southern印迹法,些微的DNA突变可以被检测出来。

  题目中提及的镰刀型细胞贫血症的基因基础,正是萨瑟恩1978年利用该方法发现的。与此同时,萨瑟恩决定使用分子生物学方法对人类基因组进行作图。为了这个计划中大规模序列分析的需要,萨瑟恩进行了多项技术革新,包括使用凝胶电泳对经限制性内切酶切割后的片段精确分子量的确定、根据凝胶结果对DNA序列进行自动读取等。

  衍生出对蛋白等生命分子的检测方法

  由于以萨瑟恩名字命名的Southern印迹法与“南方的”英文一样,随后诞生的其他印迹法分别以Northern、Western命名。

  当待分析的物质由DNA转变为RNA时,“南”变成了“北”。军事医学科学院基础医学研究所蔡仕英等在介绍《电泳的原理、应用及进展》中提道:在电流作用下,萨瑟恩成功地将DNA片段从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维膜上进行分子杂交分析,因此称为Southern印迹法。后来,艾尔文(Alwine)用类似方法也成功地将RNA从电泳胶中转印到硝酸纤维膜上作分子杂交分析,但他并没有称这一技术为Alwine印迹法,而是称之为Northern印迹法,以便与Southern印迹法相对应。

  1981年布瑞特(Burette)又成功地将SDS-PAGE胶中的蛋白质转印到膜上进行免疫学分析(如抗原抗体结合、蛋白质与配基结合等),继Alwine之后,Burette称这一技术为Western印迹法。蛋白印迹法是一项广泛用于检测细胞或组织提取物中蛋白表达水平的技术。这项技术借助抗体与目的蛋白的结合作用,测量生物样品中的蛋白质水平。

  这样一来,在印迹电泳这个家族中,仅缺一个Eastern印迹法。后来有人提议将IEF胶(即等电聚焦电泳)中的蛋白质转印到膜上的技术称为Eastern印迹法,但这一建议并未被广泛接受。Eastern印迹法是一种检测蛋白质翻译后修饰的技术,其检测目标是蛋白质上特定的修饰基团或部位,如脂肪酸链、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在Eastern印迹法的实验中,通常要先用2D电泳将蛋白质分离,然后转到膜上,再用特异的探针去检测。蛋白质的翻译后修饰是蛋白质执行功能过程中普遍存在的调控手段。

  在印迹电泳技术中,萨瑟恩作为开创者、先行者发明的技术,衍生出人们对于DNA、RNA、蛋白质等生命活动的基本分子物质的快速、准确、灵敏的检测方法,引领了“‘南’者为大、号令四方”的研究探索次序和格局。

  不仅如此,人们还举一反三,实现了菌落上的定位检测。用类似的方法将生长在琼脂培养基上的菌落做成复制皿后再转移到硝酸纤维纸上变性并与特定的放射标记的探针杂交,可以筛选出带有特定DNA片段的菌落,这种技术称为菌落杂交,又称原位杂交。

  菌落杂交,是因为生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置不变地转移到滤膜上,并在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用。这种方法对于从成千上万的菌落或噬菌斑中鉴定出含有重组体分子的菌落或噬菌斑具有特殊的实用价值。

  DNA芯片使基因测序效率提升千万倍

  诺贝尔奖的授予是为了表彰对人类做出最重大贡献的人,迄今为止,Southern杂交技术依旧活跃在生命科学研究的最前沿,并逐步走出实验室走进临床,用于疾病的诊断和检测。

  最新的研究论文显示,科研人员利用Southern杂交技术对人类的线粒体DNA进行定量。在单个细胞中线粒体DNA基因组是整体基因组的“沧海一粟”,这使得定量检测十分困难。

  量少却至关重要,线粒体DNA的缺失或突变往往是致命的,例如,在某些核苷类逆转录酶抑制剂治疗的人类免疫缺陷病毒感染患者中,线粒体毒性和线粒体DNA缺失也已报道。因此,用进一步发展的Southern印迹法来估计人类基因组DNA样品中的线粒体DNA含量十分重要。迄今为止,Southern杂交技术仍旧是兼顾稳、准、快的不可替代的DNA检测技术。“Southern杂交技术已成为检测特定DNA片段的经典方法之一。此法快速、准确、灵敏,目前已经广泛地应用于医学、病毒学、转基因动植物鉴定、动物疾病诊断以及DNA指纹分析等方面的研究。”新疆大学生命科学与技术学院教授马正海等在相关技术的改进方面做了探索总结的工作,使得该技术的实现更加便利。

  Southern印迹法的常青不衰还体现在萨瑟恩本人不间断的科研生涯中。资料显示,在发明了著名的Southern印迹杂交之后,他从英国医学研究理事会(MRC)来到牛津大学,在特殊的玻璃表面通过有效的组合化学方法合成了特定寡核苷酸序列,该方法最终发展成为DNA芯片。1996年,萨瑟恩建立了牛津基因技术公司(OGT),主要进行高通量的核酸分析工作。

  DNA芯片技术已经称为现代生命科学仪器设备绕不开的必备组件,使得检测效率实现了千万倍的提升,也使得基因测序、精准医疗的成本大大降低,有望普惠大众。

【编辑:王思硕】
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